Timothée est un nom grec et signifie "qui honore Dieu". Alors que dans les Actes, Luc le mentionne six fois, dans ses Lettres, Paul fait référence à lui au moins à dix-sept reprises (on le trouve en plus une fois dans la Lettre aux Hébreux). On en déduit qu'il jouissait d'une grande considération aux yeux de Paul, même si Luc ne considère pas utile de nous raconter tout ce qui le concerne. En effet, l'Apôtre le chargea de missions importantes et vit en lui comme un alter ego, ainsi qu'il ressort du grand éloge qu'il en fait dans la Lettre aux Philippiens: "Je n'ai en effet personne d'autre (isópsychon) qui partage véritablement avec moi le souci de ce qui vous concerne" (2, 20).
Timothée était né à Lystres (environ 200 km au nord-ouest de Tarse) d'une mère juive et d'un père païen (cf. Ac 16, 1). Le fait que sa mère ait contracté un mariage mixte et n'ait pas fait circoncire son fils laisse penser que Timothée a grandi dans une famille qui n'était pas strictement observante, même s'il est dit qu'il connaissait l'Ecriture dès l'enfance (cf. 2 Tm 3, 15). Le nom de sa mère, Eunikè, est parvenu jusqu'à nous, ainsi que le nom de sa grand-mère, Loïs (cf. 2 Tm 1, 5). Lorsque Paul passa par Lystres au début du deuxième voyage missionnaire, il choisit Timothée comme compagnon, car "à Lystres et à Iconium, il était estimé des frères" (Ac 16, 2), mais il le fit circoncire "pour tenir compte des juifs de la région" (Ac 16, 3). Avec Paul et Silas, Timothée traverse l'Asie mineure jusqu'à Troas, d'où il passe en Macédoine. Nous sommes en outre informés qu'à Philippes, où Paul et Silas furent visés par l'accusation de troubler l'ordre public et furent emprisonnés pour s'être opposés à l'exploitation d'une jeune fille comme voyante de la part de plusieurs individus sans scrupules (cf. Ac 16, 16-40), Timothée fut épargné. Ensuite, lorsque Paul fut contraint de poursuivre jusqu'à Athènes, Timothée le rejoignit dans cette ville et, de là, il fut envoyé à la jeune Eglise de Thessalonique pour avoir de ses nouvelles et pour la confirmer dans la foi (cf. 1 Th 3, 1-2). Il retrouva ensuite l'Apôtre à Corinthe, lui apportant de bonnes nouvelles sur les Thessaloniciens et collaborant avec lui à l'évangélisation de cette ville (cf. 2 Co 1, 19).
Nous retrouvons Timothée à Ephèse au cours du troisième voyage missionnaire de Paul. C'est probablement de là que l'Apôtre écrivit à Philémon et aux Philippiens, et dans ces deux lettres, Timothée apparaît comme le co-expéditeur (cf. Phm 1; Ph 1, 1). D'Ephèse, Paul l'envoya en Macédoine avec un certain Eraste (cf. Ac 19, 22) et, ensuite, également à Corinthe, avec la tâche d'y apporter une lettre, dans laquelle il recommandait aux Corinthiens de lui faire bon accueil (cf. 1 Co 4, 17; 16, 10-11). Nous le retrouvons encore comme co-expéditeur de la deuxième Lettre aux Corinthiens, et quand, de Corinthe, Paul écrit la Lettre aux Romains, il y unit, avec ceux des autres, les saluts de Timothée (cf. Rm 16, 21). De Corinthe, le disciple repartit pour rejoindre Troas sur la rive asiatique de la Mer Egée et y attendre l'Apôtre qui se dirigeait vers Jérusalem, en conclusion de son troisième voyage missionnaire (cf. Ac 20, 4). A partir de ce moment, les sources antiques ne nous réservent plus qu'une brève référence à la biographie de Timothée, dans la Lettre aux Hébreux où on lit: "Sachez que notre frère Timothée est libéré. J'irai vous voir avec lui s'il vient assez vite" (13, 23). En conclusion, nous pouvons dire que la figure de Timothée est présentée comme celle d'un pasteur de grand relief. Selon l'Histoire ecclésiastique d'Eusèbe, écrite postérieurement, Timothée fut le premier Evêque d'Ephèse (cf. 3, 4). Plusieurs de ses reliques se trouvent depuis 1239 en Italie, dans la cathédrale de Termoli, dans le Molise, provenant de Constantinople.